ANALISA KIMIA
INSTRUMENT
BAB I
PENDAHULUAN
Perkembangan ilmu
pengetahuan sejalan dengan perkembangan teknologi. Berbagai alat dengan
kecanggihan semakin meningkat. Hal ini juga termasuk perkembangan dalam bidang
farmasi. Selama beberapa tahun terakhir terjadi perkembangan yang pesat untuk
teknik pemisahan. Penerapan metode seperti kromatografi dianggap metode modern
yang saat ini sering digunakan dalam berbagai riset dan penelitian. Hal ini
terbukti dengan banyaknya publikasi ilmiah yang berkaitan dengan penggunaan
metode tersebut, baik untuk tujuan analisis kualitatif ataupun kuantitatif.
Kromatografi merupakan
suatu metode pemisahan yang akhir - akhir ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti destilasi,
kristalisasi, pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam
pelaksanaan yang lebih sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama
mempunyai kepekaan yang tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang
tinggi. Metode ini digunakan, jika dengan metode lain tidak dapat dilakukan
misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit atau campurannya kompleks.
Adanya kemajuan
teknologi dibidang elektrokimia saat ini telah memiliki peranan penting dalam
menentukan berbagai kandungan / unsur zat didalam cairan. Adanya penelitian –
penelitian baru yang memungkinkan untuk menerapkan prinsip kromatografi pada
senyawa – senyawa yang tidak berwarna termasuk gas.
Sebuah produk seperti
cairan vitamin atau obat sejenis serta produk pangan lainnya terkadang sulit
untuk membedakan dengan benar tentang unsur / zat yang terkandung didalamnya.
Kritisnya masyarakat atau konsumen dengan apa yang akan dikonsumsi baik pada
komposisi, tanggal kadaluarsa, bobot bahan yang terkandung, adanya jaminan
keamanan apabila mengkonsumsi dan lain-lain, menjadi suatu keharusan seorang
ahli farmasi menjamin kelayakan konsumsi pada obat, suplemen ataupun bahan
pangan yang akan dikonsumsi masyarakat.
Kromatografi lapis
tipis sangat membantu seorang ahli farmasi untuk mengidentifikasi kandungan
dalam suatu cairan baik obat tradisional atau obat herbal yang akhir – akhir
ini menjadi primadona dalam pengobatan di Indonesia dan untuk mengidentifikasi
kandungan yang terdapat di bahan pangan, ini menjadi alasan mengapa seorang
ahli farmasi harus mempelajari hal yang berkaitan dengan kromatografi.
BAB II
PEMBAHASAN
1. Kromatografi Secara Umum
Ø Pengertian
Kromatografi
Kromatografi di tahun 1903 Tswett menemukan teknik
kromatografi. Teknik ini bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu
campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase.
Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase
diam terjadi apabila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi ke
dalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di dalam pori. Ini
adalah sorpsi (penyerapan). Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut
tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung
berhubungan dengan bagian molekul-molekul tersebut diantara fase bergerak dan
fase diam. Jika ada perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing
komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada
karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi, masing-masing
komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat bahwa
proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial yang
dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak.
Ø Klasfikasi
Metode Kromatografi
Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokan
dengan hanya meninjau suatu macam sifat. Artinya kita dapat menyatakan teknik-teknik
kolom seperti destilasi, ekstraksi pelarut, penukar ion ke dalam satu kelas,
tetapi teknik tersebut dapat juga diklasifikasikan dengan berdasarkan
metode-metode differential migration. Pada semua
metode differential migration,pemisahan berbagai komponen campuran yang
bermigrasi pada berbagai medium tergantung pada karakteristik laju individual
komponen-komponennya, sehingga dapat dikatakan bahwa dalam kalsifikasi,
sesungguhnya terjadi tidak hanya satu sifat fisis saja yang ditinjau tetapi
ganbungan-gabungan yang digunakan dalam teknik pemisahan. Semua metode-metode
pemisahan dapat diklasifikasikan seperti dalam tabel 2.1, didasarkan pada sifat
fisiknya dan pemisahan fasenya.
Tabel Klasifikasi Kromatografi
|
No
|
Dasar
|
Pemisahan
fase kedua
|
Memebedakannya
dalam fase tunggal
|
||
|
Dengan
panas
|
Dengan
reagen
|
Dengan
bidang batas
|
Konsentrasi
tidak seragam
|
||
|
1.
|
Penguapan
|
Destilasi
|
-
|
-
|
|
|
2.
|
Koefisien
partisi
|
-
|
Kromatografi
gas
|
-
|
-
|
|
3.
|
Penukaran
|
-
|
Penukar
ion
|
-
|
-
|
|
4.
|
Aktivitas
permukaan
|
-
|
Adsorpsi
pada kromatografi gas-padat
|
-
|
Foam
fraction
|
|
5.
|
Ukuran
molekuler
|
-
|
Moleculer
sieve
Filtrasi
gel
Analisis
eksklusi ion
|
-
|
-
|
|
6.
|
Migrasi
listrik
|
-
|
-
|
-
|
Elektro
foresis
|
Dibandingkan
dengan metode pemisahan secara keseluruhan, klasifikasi metode kromatografi,
relative lebih sederhana. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan, sedangkan
fas diam dapat berupa zat cair atau padat. Jadi kita memiliki kombinasi
cair-cair, gas-cair, gas-padat. Jika pemisahan terutama meliputi suatu partisi
sederhana antara fase diam cair dan fase gerak cair juga, maka proses ini
dikenal sebagai kromatografi partisi. Jika gaya fisika ke permukaan terutama
meliputi kemampuan retensi dari fase diamnya, maka proses disebut sebagai
kromatografi adsorpsi. Jika fase bergeraknya adalah gas, metode ini disebut
sebagai kromatografi gas cair atau kromatografi gas-padat.
Untuk
senyawa yang mudah menguap, kromatografi gas merupakan cara yang menawarkan
resolusi tinggi, waktu analisis pendek dan kepekaan di daerah ppm. Metode
kromatografi cair memanfaatkan fase gerak cair untuk menggeser sampel sepanjang
kolom partisi yang diisi oleh pengadsorpsi padat atau zat padat yang diselimuti
cairan seperti dalam HPLC. Di dalam kromatografi, pertukaran ion ikatan kimia
heteropolar terbentuk secara reversible antara komponen-komponen ion di dalam
fase bergerak dan fase diam. Penyerapan gel atau filtrasi gel adalah suatu
contoh kromatografi eksklusi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis
adalah contoh-contoh kromatografi partisi. Suatu deskripsi singkat dari berbagai
metode pemisahan akan dibahas berikut ini untuk mengetahui prinsip-prinsip
dasar dan aspek-aspek analitik masing-masing metode.
- Destilasi : ini adalah penguapan zat cair dan kondensasi dari uap kembali ke fase cair. Penguapan zat cair sebanding dengan tekanan uapnya dan berbanding terbalik terhadap titik didih cairnya. Sublimasi juga suatu metode pemisahan baik. Keberhasilan metode ini tergantung pada kemudahan massa transfernya dilaksanakan jika zat berada dalam fase gas.
- Ekstaraksi pelarut.
- Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusizat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram. Prinsip kromatografi adsorpsi berhubungan juga dengan bidang-bidang lain seperti kromatografi zat padat. Pemisahan campuran ionik atau bermutan dengan differential migration dibawah pengaruh gaya pendorong potensial listrik telah dikembangkan. Pertama meliputi migrasi bebas dalam medium homogen dan migrasi kedua yang terjadi pada medium berpori yang stabil. Pertama disebut sebagai elektrofase dan yang kedua dikenal sebagai ionoforesis atau elektromatografi. Teknik yang kedua banyak diapakai dalam pemisahan.
- Teknik ring oven : teknik ini berkaitan dengan pengujian suatu tetesan tunggal larutan pada suatu kertas menyaring untuk mengetahui komponen-komponen larutan. Larutan ditetesi satu kali pada pusat kertas saring (yang berbentuk lingkaran), kemudian satu atau beberapa komponen sampel akan terekat pada kertas dengan pengendapan. Komponen-komponen terlarut dipindahkan dengan pelarut yang tepat sehingga bergeser dari pusat sampai bagian tepi kertas saring. Begitu larutan mencapai bagian tepi, penguapan pelarut terjadi dan zat terlarut akan tertinggal pada suatu area dalam bentuk cincin-cincin yang manunjukkan bahwa pemisahan dari bercak tetesan mula-mula.
- Zone melting : di sini dua wilayah tertentu yang meliputi penampang lintang suatu zat padat dilelehkan dengan perlahan-lahan digerakkan sepanjang batang zat padat. Zat terlarut akan dibebaskan pada saat pembekuan pada bidang batas padat-cair dan terbawa sepanjang wilayah serta akan menggumpal pada salah satu ujung zat padat. Imi merupakan proses selektif untuk mengluarkan pengotor.
- Penukar ion. Dalam ekslusi sifat-sifat fisika materi sintetik baru memberikan suatu era baru terhadap pemekaian materi-materi tersebut dalam pemisahan secara difusi. Misalkan dalam pengaliran larutan dengan pelarut air melalui resin, zat yang bersifat non ionik akan mendistribusikan dirinya sedemikian rupa sehingga dapat melalui fase resin, sedangkan yang senyawa ionik ditolak dari fase resin.
- Dialisis : osmosis adalah proses pemisahan berdasarkan difusi yang paling dikenal dan ini disebabakan aliran spontan sutu pelarut melalui membrane dari larutan yang encer ke larutan yang lebih pekat. Membrannya bersifat semi permeabel terhadap partikel zat terlarut. Dialisis dan osmosis sering kali terjadi secara spontan di dalam system. Dengan dialisis garam-garam dapat dipisahkan dari suspense koloid.
- Presipitasi, kopresipitasi dan sebagainya. Ini adalah suatu proses dimana suatu zat terlarut diubah ke bentuk tidak larut yang selanjutnya dapat dipisahkan dari larutannya.
i)
Flotasi :
senyawa-senyawa dengan kerapatan lebih besar dari pada cairan yang menyelimutinya
dapat dikonsentrasikan pada permukaan zat cair. Ini dikenal sebagai pemisahan
dengan teknik flotasi. Pengaliran udara melalui larutan diperlukan pada metode
ini. Suatu partikel dapat distabilkan pada permukaan seperti bidang batas
permukaan gas-cair jika suatu kontak antara padatan dan cairan nilainya
tertentu. Perbedaan sudut kontak ini menghasilkan flotasi selektif.
Bagaimanapun hanya metode kromatografi yang mempunyai peranan sangat berarti
dalam analitik.
Ø Definisi
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada
tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa
lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng
kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).
KLT
merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya
serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh
karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan (Hostettmann et al, 1995).
Pada
proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap
adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah
kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama
dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen
kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.
Kromatografi
lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan
yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada
penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang
akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah
pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang
yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler
(pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus
ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan menggunakan sinar
UV (Sudjadi, 1988).
Teknik
ini dikembangkan tahun 1938 Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada
lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan
menyerap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini di
kenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana,
cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk
memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.
Biasanya
yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel, tetapi
kadang kala bubuk selulosa dan tanah diatome juga dapat digunakan. Untuk fase
diam hidrofilik dapat digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, disperse
koloid plastic, silica terhidrasi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada
pengadsorbsi digunakan suatu aplikator. Sekarang inin telah banyak tersedia
kromatografi lapisan tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca yang telah
terlapisi, kromatotube, dan sebagainya. Kadar air dalam lapisan ini harus
terkendali agar didapat hasil analisis yang reprodusibel.
Pemilihan
sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi
yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan
suatu mikro-syringe (penyuntik berukuran mikro). Sample diteteskan pada salah
satu bagian tepi pelat kromatografi. Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap.
Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertical
searahgerakan pelarut. Teknik ascending digunakan untuk
melaksanakan pemisahan yang dilakukan pada temperature kamar, sampai permukaan
pelarut mencapai tinggi 15-18 cm. waktu yag diperlukan antara 20-40 menit.
Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat di pakai juga untuk
kromatografi lapis tipis. Resolusi KLT juah lebih tinggi daripada kromatografi
kertas karena laju difusi yang luar biasa kecilnya pada lapisan pengadsorpsi.
RRPC dapat juga dilakukan pada kromatografi lapisan ini, dengan menggunakan
lapisan yang sudah dicelupkan lebih dahulu pada perafin, minyak silikon, dan
lain-lain. Pelarut yang digunakan adalah CH3COOH atau asetonitril. Kadangkala
untuk RPPC, waktu yang diperlukan cukup lama.
Zat-zat
warna dapat terlihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent penyemprot
untuk melihat bercak suatu zat. Asam kromat sering digunakan untuk zat organic.
Demikian juga penandaan secara radiokomia juga dapat digunakan. Untuk
menempatkan posisi suatu zat, reagent dapat juga disemprotkan pada bagian tepi
saja. Bagian yang lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagent
dengan pengerokan setelah pemisahan selesai.
Untuk
analisis kuatitatif dapat digunakan plot fotodensitometri. Analisisnya dapat
dilakukan dengan spektrofotometer UV, sinar tampak, IR atau flourosens atau
dengan reaksi kolorimeter dengan reagent kromogenik.
Aplikasi
KLT sangatlah luas. Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu
labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Ia dapat pula untuk
memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia foresik menggunakan KLT
untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticizer, antioksidan,
tinta dan formulasi zat pewarna dapat ditentukan dengan KLT. Pemakaiannya juga
meluas dalam pemisahan anorganik.
Ø Kelebihan
dan Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis
Beberapa kelebihan KLT yaitu:
- KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
- Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
- Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
- Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
- Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
- Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
- Jumlah perlengkapan sedikit.
- Preparasi sample yang mudah
- Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).
Adapun kekurangan KLT yaitu:
1.
Butuh ketekunan dan
kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan.
2.
Butuh sistem trial
and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3.
Memerlukan waktu yang
cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun
Ø Prinsip
Kerja Kromatografi Lapis Tipis
Pada
dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan perbedaan
adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut
pengembang (Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi
kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase
diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai
pengganti kertas.
Pada
proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini
dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak,
serta kepolaran dan ukuran molekul.
Ø Pembuatan
Lapisan Tipis
Penyerap
dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi bentuknya baik, biasanya
digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis
dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi.
Seringkali bentuk plat kaca / aluminium dijual dengan ukuran 20 x 5 cm
atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai “standard”. Hal yang
penting yaitu bahwa permukaan dari plat harus rata. Plat -plat kaca /
aluminium sebelum dipakai dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergent
kemudian dikeringkan. Terakhir, dapat dicuci dengan aseton, tetapi hal ini
tidak mesti dilakukan. Satu hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh
permukaan dari plat yang bersih dengan jari tangan karena bekas jari tangan
yang menempel akan merubah tebal dari permukaan penyerap pada plat.
Untuk
membuat penyerap, pertama bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi
bubur, biasanya dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk
sampai rata dan dituangkan diatas plat dengan berbagai cara. Tebal lapisan
merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapisan tipis. Tebal
standard adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal ( 0.5
- 2.0 mm ) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar,
dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x
20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi
mengelupas bila kering.
Tabel Perbandingan Untuk Membuat Bubur Penyerap
|
Penyerap
|
Medium
bubur penyerap
|
Perbandingan,
gram dalam ml
|
|
Silika
gel
|
Metilena
klorida : methanol (2:2, v/v)
|
35
gr dalam 100 ml
|
|
Serbuk
selulosa
|
Metilena
klorida : methanol (50:50, v/v)
|
50
gr dalam 100 ml
|
|
Alumina
|
Metilena
klorida : methanol (70:30, v/v)
|
60
gr dalam 100 ml
|
Sifat
yang terpenting dari penyerap adalah besar partikel bubur penyerap dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap plat sangat tergantung pada kedua sifat
tersebut. Besarnya partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25
mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang
memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah
menggunakan penyerap yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom partikel yang
sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut menjadi lambat, pada
lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut yang lebih
cepat. Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan-pemisahan
dalam kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut :
Tabel Macam-Macam Penyerap Untuk Kromatografi
Lapisan Tipis
|
Zat padat
|
Digunakan untuk memisahkan
|
|
Silika
|
Asam- asam amino, alkaloid, gula,
asam-asam lemak, lipida, minyak
esensial, anion, dan kation organic,
sterol, terpenoid.
|
|
Alumina
|
Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,
vitamin-vitamin, karoten, asam-asam
amino
|
|
Kieselguhr
|
Gula, oligosakarida, asam- asam
lemak, trigliserida, asam -asam
amino, steroid.
|
|
Bubuk selulosa
|
Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
|
|
Pati
|
Asam-asam amino
|
|
Sephadex
|
Asam-asam amino, protein
|
Ø Fase
Diam dan Fase Gerak
Fase
diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin kecil
ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase
diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Silika
gel salah satu contoh fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida
(silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen
yang besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada
gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain
Si-O-Si.
Permukaan
silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen
dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.
Fase
diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta
penggunaannya mirip silika gel.
Tabel Fase Diam Yang Sering Digunakan Pada KLT (Kealey
Dan Haines, 2002)
|
Fasa Diam
|
Mekanisme Sorpsi
|
Penggunaan
|
|
Silika gel
|
Adsorpsi
|
Asam amino, hidrokarbon, vitamin,
alkaloid
|
|
Serbuk selulosa
|
Partisi
|
Asam amino, nukleotida, karbohidrat
|
|
Selulosa penukar ion
|
Pertukaran ion
|
Asam nukleat, nukleotida, halida dan
ion-ion logam
|
|
Gel sephadex
|
Eksklusi
|
Polimer, protein, kompleks logam
|
|
Β-siklodekstrin
|
Interaksi adsorpsi stereospesifik
|
Campuran enansiomer
|
Adsorben yang sering digunakan antara
lain :
a) Silika
gel
Yang
paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering ditambah
CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga. Penambahan ini
juga mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat ditambahkan indicator
fluoresensi yang akan berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga noda
yang mengabsorpsi pada frekuensi ini menjadi sangat kontras terhadap latar
belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica gel sangat higroskopis, pada
humaditas relative 45 – 75% akan menarik air sampai 7 – 20%. Derajat
diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana pemisahan akan
dilakukan atau tempat penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian juga penting karena
dapat mempengaruhi watak kromatografi beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam
adsorben ini dapat juga menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.
b) Alumina
Bersifat
basa lemah. Tidak sebaik silica gel dan lebih relative secara kimia hingga
untuk senyawa yang sensitive dapat terdegrasi. Juga dapat ditambah Ca2SO4 dan
indicator fluoresensi.
c) Kieselguhr
(tanah diatome)
Merupakan
adsorben netral dengan aktivitas rendah. Daya resolusinya juga kecil. Dapat
ditambahkan sebagai campuran pada silikagel yang akan memberikan adsorben
campur yang kurang aktif. Juga dapat ditambah Ca2SO4.
d) Selulosa
Dengan
menggunakan selulosa sebagai adsorben akan didapat lapis tipis yang sifatnya
analog dengan kromatografi kertas. Memberikan lapis tipis yang baik tanpa
pengikat. Adsorben ini dapat ditambah indicator fluoresensi atau Ca asetat.
Kerugian penggunaan selulosa ini ialah tidak dapat digunakannya pereaksi yang
korosif seperti asam sulfat atau pereaksi destruktif lainnya.
e) Poliamida
Merupakan
magnesium silikat. Daya melekatnya tidak sebaik adsorben lainnya. Biasanya
ditambahkan pengikat seperti selulosa atau amilum. Mempunyai kapasitas yang
besar dan banyak digunakan untuk pemisahan fenol.
Selain
fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan
penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam
(adsorbent). Interaksi
antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya
pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi
dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan
teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam
hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah
lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat
mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).
Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved
like” (Watson, 2010).
Ø Prosedur
Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis
Pada
KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah
garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes
larutan sampelditempatkan di atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan
pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan posisi
asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua
ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai
kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan
berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fasa
gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana
dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.
Pelarut
(fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari
campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki
warna yang berbeda.Diagram menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak
sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai
bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen
pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
Identifikasi
dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan
dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan
harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat
bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga
Rf didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):
Harga-harga
Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga
standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku
untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar
dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap
dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).
Ø Deteksi
Bercak
Ada dua cara untuk menyelesaikan
analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:
1. Menggunakan
pendarflour
Fase diam pada
sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan
berpendar.
Pendaran ini
ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti
bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil
yang gelap.
Sementara UV
tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari
bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah
bercak-bercak itu. Karena jika kita mematikan sinar UV tersebut,
bercak-bercaknya tidak tampak kembali.
2. Penunjukkan
bercak secara kimia
Dalam
beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan
cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang
berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari
campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan
larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam
metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama
dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak
pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada
lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Ø Instrument
Kromatografi Lapis Tipis
1. Detektor
Detektor
pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers. Komponen didalam
phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube (tabung vakum
photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam
multi alkali), struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki
spectral sensitivity 185-850 nm). Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan
logam katoda disinari dengan seberkas cahaya dan sejumlah elektron terpancar
dari permukaannya, yang biasa disebut dengan efek fotoelektrik dengan kondisi
hampa udara.
Elektron
yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul dan
dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan
dan keluar mengenai anoda. Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi
W (eV), yang dikenal sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda
memilki fungsi kerja yang berbeda pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai
permukaan fotosensitif, dibawah panjang gelombang pancung (cutoff
wavelength) λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan menyebabkan
terjadinya pemancaran fotoelektron. Cahaya yang masuk difokuskan dengan
melewati focusing electrode dan elektron mengenai dynode pertama kemudian
dipantulkan dan dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir
(proses pengalian) sehingga terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul
tegangan.
2. Monokromator
Monokromator
adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan
satu panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar tampak
dan infra merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan
prisma atau grating. Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma
Bunsen dan monokromator grating Czerney-Turney. Fungsi prisma adalah untuk
memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya menjadi sinar
monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah
prisma, maka cahaya tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat
berbagai warna merah, jingga, hijau, biru, dan lain-lain).
3. Absorbansi
Penyerapan
hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang diperlukan
untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat
tereksitasi (atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat
padat). Dengan spektroskopi dari cahaya transmisi bisa diketahui
tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.
Berkas
radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan
menaikan tingkat energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai
dengan panjang gelombang yang diserapnya.
Rumus yang digunakan untuk menghitung
besarnya energi yang diserap:
E = h x ν = h x C /λ = h x C / v
dimana, E = energi yang diserap
h = tetapan Planck = 6,626 x 10-34
v
= frekuensi
C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det
λ = panjang gelombang
ν = bilangan gelombang
Absorbansi dengan simbol A dari suatu
larutan merupakan logaritma dari 1/T atau logaritma Io/It.
A = log (1/T) = log (Io/It) = -
log (T) (1.4)
dimana, A =
Absorbansi / serapan
Io =
Intensitas sinar yang datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
T = Transmitance / transmitansi
4. Transmitansi
Apabila
suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu
larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga
intensitas radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io.
Transmitansi dengan simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi yang
diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu : T = It/Io. Transmitansi
biasanya dinyatakan dalam persen (%).
Ø Faktor
– Faktor yang Mempengaruhi Kromatografi Lapis Tipis
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan
noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf
adalah :
1. Struktur
kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2. Sifat
dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya
aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan
molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan
penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga
Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi
hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan
penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada)
dicampur hingga homogen.
3. Tebal
dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada
prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran
pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4. Pelarut
(dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian
dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan
tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka
perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
5. Derajat
kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik
percobaan.
Arah
pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan,
karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar
juga digunakan).
7. Jumlah
cuplikan yang digunakan.
Penetesan
cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda
dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya,
hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8. Suhu.
Pemisahan-pemisahan
sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah
perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau
perubahan-perubahan fase.
9. Kesetimbangan.
Ternyata
bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi
kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap
pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap
pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan
permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada
bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Ø Cara
Menggunakan KLT
KLT
sangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen dalam sampel. Peralatan yang
digunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses KLT), pinset, plat KLT,
dan eluen. Langkah – langkah memakai KLT sebagai berikut :
1.
Potong plat sesuai
ukuran. Biasanya, untuk satu spot menggunakan palt sebesar 1 cm. Berarti jika
menguji 3 sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm.
2.
Buat garis dasar (base
line) di bagian bawah,sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan garis akhir
dibagian atas .
3.
Menggunakan pipa
kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat diatas base
line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut. Keringkan totolan.
4.
Dengan pipet yang
berbeda, masukkan masing-masing eluen kedalam chamber dan campurkan.
5.
Tempatkan plat pada
chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh eluen. Tutuplah
chamber.
6.
Tunggu eluen mengelusi
sampel sampai mencapai garis akhir, disana pemisahan akan terlihat.
7.
Setelah mencapai
garisakhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot
tidak kelihatan, amati pada lampu UV.
Jika masih tak terlihat, semprot dengan pewarna tertentu seperti kalium kromat,
asam sulfat pekat dalam alkohol 96%, atau ninhidrin.
Dibawah ini
gambar dari langkah-langkah tersebut:
Ø Aplikasi
KLT Pada Bidang Pangan
Pada
penelitian analisis kualitastif pewarna rhodamin B dalam sampel saus tomat.
Sampel dianalisis dengan metode Kromatografi Lapis Tipis. Zat warna dari sampel
saus tomat ditarik kedalam benang wol bebas lemak dalam suasana asam sampai
benang wol tersebut terwarnai oleh pewarna saus tomat.
Setelah
benang wol terwarnai oleh pewarna saus tomat, pewarna tersebut dilepaskan ke
dalam larutan basa. Larutan basa tersebut selanjutnya akan digunakan sebagai
cuplikan sampel pada analisis Kromatografi Lapis Tipis. Noda totolan sampel
dibandingkan dengan noda totolan baku standar rhodamin B yang telah dieluasi
bersama-sama dan dilihat di bawah lampu UV pada λ 366 dan λ 254 nm, apabila
terdapat zat pewarna rhodamin B dalam sampel maka noda pada lempeng KLT akan
berflouresensi di lampu UV pada λ 366 nm dan tidak berflorousensi dilampu UV pada
λ 254 nm, pada penelitian ini noda totolan sampel pada lempeng KLT tidak
menunjukan flouresensi di lampu UV pada λ 366 nm, sehingga dapat disimpulan
bahwa pada sampel saus tomat ini tidak terkandung zat pewarna rhodamin B.
BAB III
KESIMPULAN
Kesimpulan :
1.
Kromatografi adalah
teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat
atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
2.
KLT merupakan salah
satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya
serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen,
3.
Keuntungan KLT yaitu
ketepatan penentuan kadar baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan
bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya memerlukan waktu untuk menentuan
sistem eluen yang cocok.
4.
Prinsip KLT yaitu
pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi
oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.
5.
Pembuatan lapis tipis
KLT dimulai dari penyerap dituangkan diatas permukaan plat yang kondisi
bentuknya baik, biasanya digunakan plat kaca / aluminium. Ukuran yang digunakan
tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana
kromatografi. Seringkali bentuk plat kaca / aluminium dijual dengan
ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dua ukuran ini dianggap sebagai
“standard”.
6.
Kromatogram adalah
output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.
7.
Fase diam yang
digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel
antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Fasa gerak/eluent yang
berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati
fasa diam (adsorbent).
8.
Kerja dengan KLT
dimulai dari penyiapan plat, eluen dan sampel, penotolan, elusi, dan deteksi
bercak/noda.
9.
Cara mendeteksi bercak
ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat kimia tertentu.
10. Terdapat
beberapa instrument pada kromatografi lapis tipis diantaranya adalah detector,
monokromator, absorbansi, dan transmitansi.
11. Faktor-faktor
yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga
mempengaruhi harga Rf adalah :
a.
Struktur kimia dari
senyawa yang sedang dipisahkan.
b.
Sifat dari penyerap dan
derajat aktifitasnya.
c.
Tebal dan kerataan dari
lapisan penyerap.
d.
Pelarut (dan derajat
kemurniannya) fase bergerak.
e.
Derajat kejenuhan dan
uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
f.
Teknik percobaan.
g.
Jumlah cuplikan yang
digunakan.
h.
Suhu
i.
Kesetimbangan.
12. Aplikasi
KLT pada bidang pangan adalah pada penelitian analisis kualitastif pewarna
rhodamin B dalam sampel saus tomat.
DAFTAR PUSTAKA
Arifin,
Fury. 2012. Kromatografi Lapis Tipis. http://nonasandha.blogspot.com. Diakses : 03 Desember 2014
Ayu.
2013. Analisa Pengukuran Kadar Larutan. http://s1farmasiayu.blogspot.com.Diakses : 03 Desember
2014
Khopkar,
SM. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia
Press.
Nurhidayat,
Iim. 2011. Kromaografi Lapis Tipis. http://sectoranalyst.blogspot.com. Diakses : 03 Desember
2014
Sendana,
Endra. 2013. Kromatografi Lapis Tipis. http://ndrasendana.blogspot.com. Diakses : 03 Desember
2014
No comments:
Post a Comment